Clinical and molecular characteristics of COVID-19 patients with persistent SARS-CoV-2 infection | Nature Communications
https://www.nature.com/articles/s41467-021-23621-y#article-info
影響因子： 12.121PMID：34108465
期刊年卷：Nat Commun 2021 06 09;12(1)
綜合性期刊二區 綜合性期刊 Q1 3/64
DOI：10.1038/s41467-021-23621-y
摘要
具有持續性 SARS-CoV-2 感染的 COVID-19 患者的特徵尚未得到很好的描述。在這裡，我們比較了病毒脫落持續時間長 (LDs) 患者與病毒脫落持續時間短的患者 (SDs) 和健康供體 (HDs) 患者的臨床和分子特徵。我們發現幾種細胞因子和趨化因子，如白細胞介素 (IL)-2、腫瘤壞死因子 (TNF) 和淋巴毒素 α (LT-α) 在 LD 中的含量低於 SD。單細胞 RNA 測序顯示自然殺傷 (NK) 細胞和 CD14 +LDs 中單核細胞減少，而調節性 T 細胞增加；此外，LDs 中的 T 和 NK 細胞比 SDs 中的活化更少。重要的是，LDs 中的大多數細胞顯示核醣體蛋白 (RP) 基因和相關通路的表達降低，RP 水平與感染持續時間之間的這種反向相關性在 103 名獨立患者中得到進一步驗證。因此，我們的結果表明免疫抑制和低 RP 表達可能與 COVID-19 患者病毒感染的持續存在有關。
在此，我們檢查了 38 個 SD、12 個 LD 和 22 個 HD 中的 48 種血清細胞因子/趨化因子水平。此外，還收集了來自 3 個 HD、9 個 SD 和 5 個 LD 的新鮮 PBMC，並進行了 10x Genomics 單細胞 RNA 測序 (scRNA-seq)，以剖析和比較與持續病毒感染相關的潛在變化。我們發現幾種細胞因子/趨化因子（IL-2、TNF 和 LT-α）在 LD 中的含量低於 SD。單細胞 RNA 測序表明 LD 中的免疫抑制狀態和低 RP 基因表達。此外，我們提供了一個資源來揭示持續感染 SARS-CoV-2 的 COVID-19 患者的臨床和分子特徵，這可能對理解和控制 COVID-19 具有重要意義。
結果
樣本特徵
病毒脫落的持續時間被定義為從發病直到連續陰性檢測SARS-CoV的-2 RNA的，具有COVID-19的其他研究一致的間隔19，20。截至 2020 年 4 月 30 日，共有 12 名非危重 COVID-19 住院患者表現出長時間的病毒脫落（> 45 天）。鑑於SARS-CoV-2 病毒排出持續時間的中位數約為3 週21，我們還收集了38 名年齡和性別匹配的非危重COVID-19 住院患者，其病毒排出持續時間<21 天以進行比較（補充表1）。所有患者均被確認為中國武漢同濟醫院實驗室確診的 SARS-CoV-2 感染患者。 LDs 和 SDs 的中位病毒脫落持續時間分別為 57 天（範圍：45-100 天）和 16 天（範圍：3-21 天）（對數秩p < 0.0001）（補充表 1）。這些患者的基本人口統計學信息和臨床參數比較詳見補充表1. 值得注意的是，LDs 和SDs 在合併症、全血細胞計數（白細胞計數、淋巴細胞計數、中性粒細胞計數、血小板計數和血紅蛋白）、血液生化（丙氨酸/天冬氨酸氨基轉移酶和乳酸脫氫酶）和凝血功能方面沒有顯著差異（凝血酶原、活化部分凝血活酶時間和D-二聚體）。此外，炎症標誌物，如降鈣素原、紅細胞沉降率(ESR) 和c 反應蛋白(CRP)，已被廣泛報導為發生嚴重COVID-19 的高危因素22 , 23 , 24, 在LD 和SD 中也具有可比性。因此，迫切需要進一步調查以確定病毒排放持續時間的新指標和持續病毒排放的潛在機制。
SD、LD 和 HD 中的細胞因子
細胞因子是 COVID-19 病理生理學的核心，「細胞因子風暴」被描述為 COVID-19 嚴重程度的一個特徵，這與不良結果相關25 , 26。為了進一步闡明與病毒脫落持續時間相關的免疫反應，我們檢查了 38 個 SD、12 個 LD 和 22 個 HD 中的血清細胞因子/趨化因子水平。有趣的是，在檢測到的 48 種細胞因子/趨化因子中，與 SD 或 HD 相比，21 種炎性細胞因子/趨化因子在 LD 中的水平最低（圖 1c）。其中，血小板衍生生長因子(PDGF-BB) ( p = 0.000065)、CC 基序配體5 (CCL5) ( p = 0.00011) 和巨噬細胞遷移抑制因子(MIF) ( p = 0.00015) 顯示出最顯著的變化（圖1c和補充圖1）。此外，IL-1β，IL-2，IL-2R，IL-9，IL-18，TNF和LT-α，其中的上調促成肺損傷，多器官衰竭，並最終導致死亡27，28，29，在LD 中以較低水平存在（圖1c）。總的來說，持續的病毒脫落與較弱的炎症反應有關，其特徵是細胞因子和趨化因子的循環濃度低。
image
圖 1：LD 和 SD 中的病毒學、臨床和細胞因子/趨化因子特徵
a採用 Kaplan-Meier 方法估計病毒 RNA 的陽性率，並應用雙邊對數秩檢驗評估 LDs（n =12）和 SDs（n =12）中病毒脫落持續時間的顯著性差異（n = 38）。
b從LDs（n = 12）和SDs（n = 38）的臨床記錄中獲得的C反應蛋白（CRP）值以及從LDs（n = 10）和SDs（n = 10）的臨床記錄中獲得的紅細胞沉降率（ESR）值（n = 38）。箱線圖顯示了中位數（中線）以及第一和第三個四分位數（箱），而鬍鬚顯示箱上下的四分位距 (IQR) 的 1.5 倍。進行了非配對雙尾學生t檢驗。
c來自HDs ( n = 22)、LDs ( n = 12) 和SDs ( n = 38) 被收集，並進行測定以測量48 種細胞因子/趨化因子的濃度，其中顯示了20 種具有統計學意義。 Y軸代表細胞因子濃度(pg/ml)。箱線圖顯示了中位數（中線）以及第一個和第三個四分位數（框），而鬍鬚顯示了框上方和下方 1.5 倍的 IQR。進行單邊 Wilcoxon 秩和檢驗。
源數據作為源數據文件提供。
SDs、LDs和HDs中PBMCs的細胞組成差異
為了表徵 LDs 和 SDs 與 HDs 相比的免疫學特徵，我們進行了 10x Genomics scRNA-seq 以研究來自 3 個 HDs、9 個 SDs 和 5 個 LDs 的 PBMCs 的轉錄組譜（補充表 2）。這些患者的人口統計學、臨床特徵和實驗室檢查結果列於補充表 2 中。在統一的單細胞分析管道（參見方法）之後，來自所有受試者的總共167,946 個細胞（每個樣本平均9879 個細胞）被整合到一個非批處理和可比較的數據集中（補充表2） 。根據之前的報告30，我們沒有在這些患者的 PBMC 中檢測到 SARS-CoV-2 RNA 表達（補充圖 2）。
使用統一流形近似和投影（UMAP）的無監督聚類，我們根據典型細胞類型基因標記的表達鑑定了 20 個細胞群（圖 2a-b，補充圖 3）。為了揭示 LD 和 SD 細胞組成的差異並將它們與 HD 的細胞組成進行比較，我們研究了三組中免疫細胞的相對比例（圖 2c-d）。 LDs中NK細胞的比例顯著降低（圖 2d）。 CD14 +單核細胞在 LDs 中最低，與 SDs 相比，LDs 顯示出略微顯著的下降趨勢（p = 0.06）。值得注意的是，據報導，由 T 細胞誘導的炎性單核細胞會引發 COVID-19 中的細胞因子風暴31。 LDs中 NK 細胞和 CD14 +單核細胞的大量減少與觀察到的 LDs 中炎性細胞因子的減少一致32。此外，三組LDs中Treg的比例顯著最高（圖 2d）。鑑於 Treg 在分泌免疫抑制細胞因子和抑制先天性和適應性免疫細胞活化方面的重要性33 , 34，統計上顯著升高的 Treg 水平可能有助於抑制 LDs 中觀察到的免疫反應。綜合來看，NK細胞和CD14 +單核細胞呈下降趨勢，Treg升高可能與免疫抑制狀態和病毒在LDs中的持續存在有關。
image
圖 2：PBMC 單細胞轉錄組的細胞組成差異
a163,498 個單細胞UMAP 圖，按從 HD（n = 3）、SD（n = 9）、LD（n = 5）識別的細胞類型著色。
b 20 個聚類中的小提琴圖顯示的選定規範標記的表達分布。
c在單個樣品水平上每種細胞類型的比例。
d每組中每個細胞簇比例的箱線圖。 HD（n = 3）、SD（n = 9）、LD（n = 5）以不同顏色顯示。水平線代表中值，最大值為 1.5 × 四分位距。在每組之間進行單邊 Wilcoxon 秩和檢驗。源數據作為源數據文件。
與 LD 相關的轉錄簽名
接下來，我們根據 HDs 的相對基因表達變化進行層次聚類，以評估 LDs 和 SDs 中每種細胞類型的分子差異。出乎意料的是，除了血漿 B 細胞和巨核細胞外，PBMC 中的所有細胞類型都根據疾病組而不是細胞類型聚集在一起（補充圖 4））。這表明 LDs 和 SDs 中 PBMC 的分子特徵明顯不同，無論細胞類型如何。因此，我們試圖通過差異表達基因 (DEG) 和基因腫瘤學 (GO) 分析來確定單個細胞類型中相關生物學功能的變化。最重要的是，我們發現靶向膜的蛋白質、內質網(ER) 相關通路和翻譯相關通路在LD 的所有細胞類型中均持續下調，除了γδ (γδ) T 細胞、黏膜相關不變T細胞（MAIT）和巨核細胞（圖3a）。與GO分析結果一致，許多編碼RP和免疫相關基因的基因在LDs中被特異性下調（圖 3b-c）。特別是，RPL41、RPS29、RPL36A、RPS27、RPS21、RPS10、RPL38、RPL39 和 RPS28 定位於 ER 並參與蛋白質合成、折疊和組裝，詳見https://www.proteinatlas上提供的信息。組織。 TMA7 35、TAF10 36和PTOV1 37在LDs 中也被特異性下調。先前已報導這些基因與核醣體相關，並且它們的過度表達促進全局蛋白質合成。鑑於抗體38和細胞因子39由粗糙的ER 和附著的核醣體合成、折疊、修飾和組裝，這些發現表明LD 的免疫細胞往往具有減少的細胞因子合成、折疊和組裝功能，這與觀察到的較低水平的炎性細胞因子一致LD（圖1c）。參與促炎細胞因子產生的 CEBPD 和 MAP2K2 以及參與 IL-2 產生的RAC1 40在 LD 中選擇性減少（圖 3b-c）。此外，LDs 中參與T 細胞活化（PCBP1、ARPC2）、遷移（FMNL1）、細胞毒功能（GNLY、SRM）、轉錄因子（LYN）和下游信號轉導（COTL1）的基因都減少了（圖3b- c）。鑑於細胞因子是由幾種免疫細胞產生的，包括適應性 T 細胞41，這些發現至少部分解釋了 LDs 中細胞因子水平的降低。
image
圖 3：與長病毒脫落持續時間相關的轉錄特徵
a在細胞類型解析度下，LDs 和 HDs 之間下調基因富集GO 通路。由核醣體基因富集的通路用紅色標記。顏色強度表示富集p值，點大小表示每個途徑中基因富集的比例。
b 17 個樣本中所選基因的表達水平。顏色強度表示相對錶達水平。
c在細胞類型解析度下組間選定基因的表達。顏色強度表示相對錶達水平，點大小表示每個基因表達的細胞比例。點圖下方的顏色條表示該組。
d103 名 COVID-19 患者全血批量 RNA 中核醣體基因的表達水平。顏色強度表示相對錶達水平，熱圖下方的顏色條表示疾病組，散點表示 COVID-19 的持續時間。
e左：103 名 COVID-19 患者中選定核醣體基因的表達水平與
COVID-19 的持續時間之間的相關性（95% 置信區間）。右圖：103 名 COVID-19 患者中三組所選基因表達水平的箱線圖（G1：n = 52；G2：n = 38；G3：n = 13）。水平線代表中值，最大值為 1.5 × 四分位距。三組之間的差異通過單側 Wilcoxon 秩和檢驗進行。源數據作為源數據文件提供。
此外，為了更好地支持觀察結果的普遍性，我們進一步重新分類、過濾了最近一項研究42 中已發表的 scRNA-seq 數據。符合以下標準的新鮮PBMC患者納入分析：（1）HDs：對照組；(2) SDs：症狀出現後21天內且已處於恢復期的天數；(3) LDs：發病超過45天後症狀仍在發展。最後，選擇了 38 名 COVID-19 患者（20 個 HD、16 個 SD 和 2 個 LD）的數據進行分析。由於 LD 中的樣本只有 T 細胞數據（通過流式細胞術（CD3 +))，我們在這部分數據分析中比較分析了T細胞。使用 UMAP 的無監督聚類，鑑定了基於經典細胞類型基因標記表達的 9 個細胞群（補充圖 5a-c）。與我們的結果一致，GO 分析表明，在 LD 中幾乎所有 T 細胞亞型中，靶向膜的蛋白質、ER 相關途徑、翻譯相關途徑和免疫反應途徑始終被下調（補充圖 5d）。這些結果共同支持LDs中細胞因子的合成、折疊和組裝功能可能會減少。
為了進一步評估核醣體蛋白 (RP) 水平與病毒脫落持續時間之間的關聯，我們整合了來自 103 名獨立 COVID-19 患者的大量 RNA-seq 數據。值得注意的是，我們發現 RP 的較低表達與較長的病毒脫落持續時間相關，包括在 scRNA-seq 數據中鑑定的以下 RP：RPL38、RPL41 和 RPS10（圖 3d-e）。總之，RP 水平與病毒脫落持續時間呈負相關。是否可以應用特定的 RP 作為持續病毒感染的指標，值得進一步探討。
LDs 和 SDs 中 T 和 NK 細胞的分子特徵
接下來，我們進行的T細胞和NK細胞亞聚類分析考慮其重要的抗病毒效果43，44。來自所有樣品的 T 和 NK 細胞的 UMAP 嵌入確定了 CD4 + T、CD8 + T、NKT 和 NK 細胞的細胞表型的顯著差異（圖 4a-b）。此外，相關矩陣顯示兩組之間的分子特徵不同（圖 4c），例如記憶 CD8 + T 細胞和 NK 細胞。
image
圖 4：T 和 NK 細胞的亞聚類分析
aT 和 NK 細胞UMAP 投影。每個點對應一個細胞，按細胞類型著色。
b 12 個細胞簇中典型標記的 UMAP 圖。數據根據對數縮放的表達水平著色。
c使用 T 細胞和 NK 細胞疾病組之間標準化轉錄組的 Pearson 相關係數 (PCC) 進行分層聚類。
顏色強度表示 PCC，熱圖上方的顏色條表示細胞類型和疾病組。
例如，在記憶CD8 + T 細胞中，參與T 細胞激活的DEG（SELENOK、FYN、CCL5 和RNF125）、細胞因子產生的正調節（IRF1、SELENTOK 和HMGB2）、促炎分泌介質和IFN- γ 通路（ IRF1、HLA-DRB1、CCL5 和CCL4）在LD 中特異性下調，而與HD 相比，它們在SD 中上調（圖5a-b）。
image
圖 5：LD 和 SD 中 T 細胞的分子特徵
a記憶CD8 + T 細胞中COVID-19 組富集GO 通路（頂部2 列：LD 和SD 之間的DEG，底部4 列：SD 和LD 與HD 相比的DEG。由SD 上調基因富集的通路用紅色標記。顏色強度表示富集p值，點大小表示每個通路中基因富集的比例
b樣本水平的記憶 CD8 + T 細胞中 DEGs 表達的層次聚類。顏色強度表示每個基因的相對錶達。
c， d T細胞並且在三組不同的細胞類型的解析度的克隆狀態百分比。
e 三組中所選克隆類型的百分比。源數據作為源數據文件提供。
鑑於 Treg 在抑制先天性和適應性免疫細胞活化方面的重要性32 , 45。除了比較 Treg 的數量（圖 2d），我們進一步計算了它們的調節得分（參見方法），並且三組之間 Treg 的功能得分沒有變化（補充圖 6a）。相反，CD8 +細胞毒性 T 淋巴細胞在細胞介導的針對病毒感染靶細胞的細胞毒性中起關鍵作用46. 提出了另一種可能性，即免疫抑制 LDs 可能具有更多耗竭的細胞。因此，我們開發了耗竭評分來評估三組細胞毒性 T 細胞的耗竭（參見方法）。值得注意的是，LDs 中的細胞毒性 T 細胞顯示出顯著最高的耗竭分數（補充圖 6b）。再一次，升高的 Treg 計數和耗盡的細胞毒性 T 細胞可能與免疫抑制狀態和 LD 中病毒脫落的持續性有關。
接下來，我們從 TCR 測序數據重建了 T 細胞抗原受體 (TCR) 序列。簡而言之，除了 γδT、NK 和 NKT 亞群外，所有亞群中超過 70% 的細胞具有匹配的 TCR 信息（圖 5c）。與 HD 相比，COVID-19 患者的克隆擴增明顯，尤其是病毒脫落 SD 患者（圖 5d）。與上面顯示的 T 細胞和 NK 細胞免疫激活減少一致，主要在 LD 中的細胞毒性細胞中的大克隆擴增（克隆大小 >30）的比例很低（圖 5d）。
為了探索 SD 和 LD 中優先的 V 和 J 組合，我們首先分析並列出了所有樣本中 TCR 中最常觀察到的 V 和 J 組合（圖 5e）。在這些組合中，HD中TCR相對頻繁的配對是TRBV28::TRVJ2-7和TRAV29/DV5::TRAJ20，而TRAV29/DV5::TRAJ49和TRBV9::TRBJ1-3在LD中頻繁出現，而TRAV17: : TRAJ48 和TRBV15::TRBJ2-5 在SD 中很常見（圖5e）。 V(D)J 基因的選擇性使用表明，不同的免疫優勢表位可能驅動 T 細胞反應的分子組成，並可能與長期或短期病毒感染有關。
此外，在NK 細胞中，與SDs 相比，與T 細胞活化途徑（ZFP36L2、KLF2、IRF1、LYN、RAC1、JUNB 和CXCR4）的正調控相關的DEGs 也顯著減少了LDs（圖6a-b） .總之，這些結果表明T 細胞和NK 細胞免疫激活減少，支持LD 的免疫抑制狀態。
image
圖 6：LD 和 SD 中 NK 細胞的免疫學特徵
a NK 細胞中COVID-19 組富集的GO 通路（前2 列：LDs 和SDs 之間的DEG，底部4 列：SDs 和LDs 與HDs 相比的DEGs。由SDs 上調基因富集的通路用紅色標記。顏色強度表示富集p值，點大小表示各通路中基因富集的比例b NK細胞中DEGs在樣本水平上的表達層次聚類，顏色強度表示各基因的相對錶達量。
LDs中B細胞亞群的特徵
一些 T 細胞和細胞因子促使 B 細胞成熟，這些細胞會繼續成為漿細胞並產生病原體中和抗體47。我們根據典型 B 細胞標記物的表達和分布將 B 細胞亞群分為三個子集（補充圖 7a-b）。與 HD 相比，SD 中的血漿 B 細胞沒有顯著增加，這可能是由於恢復期48期間的採樣（補充圖 7a，圖 2d）。在LDs中，儘管病毒持續存在，但漿細胞的比例也極低，這可能表明LDs未能產生足夠的中和抗體（補充圖 7a，圖 2d））。之前的研究6、49表明，漿細胞在最初接觸 SARS-CoV-2 時產生的抗體會在幾週內消失，但記憶 B 細胞會持續更長時間。因此，我們比較了三組記憶 B 細胞的表達譜。有趣的是，參與T 細胞分化（CD83、ZFP36L2 和GPR183）以及細胞生長和激活（CD83、ZFP36L2、GPR183 和PELI1）的通路在SDs 中選擇性富集，但在LDs 中沒有，表明LDs 中的B和T 細胞可能無法協同清除病毒（補充圖7c-d）。此外，RAC1 和 PDE4B 積極調節細胞因子（如 IL-2）的產生，以及參與白細胞趨化性的途徑（LYN、DUSP1 和 RAC1）專門富含 SD（補充圖 7c-d）